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http://localhost:8080/tede/handle/tede/354| Tipo do documento: | Dissertação |
| Título: | Produção de esferoides a partir de células-tronco/estromais de tecido adiposo humano para fabricação de tecido ósseo in vitro |
| Autor: | Kronemberger, Gabriela Soares |
| Primeiro orientador: | Baptista, Leandra Santos |
| Segundo orientador: | Pereira, Karina Ribeiro da Silva |
| Primeiro membro da banca: | Baptista, Leandra Santos |
| Segundo membro da banca: | Pereira, Karina Ribeiro da Silva |
| Terceiro membro da banca: | Pereira, Leonardo da Cunha Boldrini |
| Quarto membro da banca: | Souza, Kleber Luiz de Araujo e |
| Quinto membro da banca: | Sant' anna Filho, Celso Barbosa de |
| Resumo: | A nova formação do tecido ósseo é desejável em uma variedade de cenários patológicos, como a osteoporose. Células-tronco/estromais derivadas do tecido adiposo (ASCs, do inglês adipose derived stem/stromal cells) são consideradas uma fonte celular promissora para a formação deste tecido in vitro através de técnicas de engenharia tecidual. Uma nova abordagem na área de engenharia de tecidos corresponde à utilização de esferoides de células-tronco como unidades modulares para fabricar tecidos biológicos in vitro. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi padronizar um modelo de indução osteogênica in vitro a partir de esferoides de ASCs humanas fabricados em hidrogel de agarose micromoldado. ASCs foram isoladas por dissociação mecânica de amostras de lipoaspirado humano obtidas de acordo com o comitê local de ética em pesquisa. Duas estratégias para a indução à diferenciação osteogênica foram testadas em esferoides de ASCs fabricados em hidrogel de agarose micromoldado. Esferoides mantidos em meio de cultivo sem fatores indutores foram mantidos como controles. Medidas do diâmetro dos esferoides foram realizadas a partir de imagens de microscopia óptica de contraste de fase. Esferoides induzidos por hrBMP-7 e por TGF-β3 apresentaram média de diâmetro 370µm e 450µm respectivamente. Esferoides induzidos por hrBMP-7 apresentaram alta viabilidade celular (85%), avaliada por exclusão de 7-AAD detectada por citometria de fluxo. Esferoides induzidos por TGF-β3 também apresentaram elevada viabilidade celular ao longo das semanas de cultivo, avaliada por kit comercial de fluorescência. Esferoides induzidos por TGF-β3 apresentaram mais depósitos de cálcio do que os induzidos por hrBMP-7, identificado por coloração de alizarina vermelha em cortes histológicos. Em ambos os casos, as análises por microanálise de raio-X (EDX) mostraram a presença de cálcio apenas em esferoides induzidos. Esferoides induzidos por hrBMP-7 apresentaram maior expressão de mRNA de fosfatase alcalina (p = 0,0015) e menor expressão de TSP1 (p = 0,00016) do que esferoides controles. No entanto, não houve diferença na expressão de RUNX2 e Sox9. Esferoides induzidos por TGF-β3 apresentaram maior composição de componentes típicos da matriz extracelular óssea, como colágeno I, osteocalcina, osteopontina, biglicana e tenascina C, avaliada por imunohistoquímica do que os induzidos por hrBMP-7. Além disso, a resistência mecânica à compressão de esferoides induzidos por TGF-β3 foi superior à de esferoides induzidos por hrBMP-7 (média de 360µN e 20µN, respectivamente). Portanto, foi possível padronizar um modelo de indução osteogênica in vitro de esferoides de ASCs humanas. Conclui-se ainda que a indução por TGF-β3 seguida de indução com meio osteogênico forma esferoides diferenciados com maior eficiência de diferenciação osteogênica do que esferoides induzidos por hrBMP-7. Neste trabalho, foi possível padronizar um modelo de indução osteogênica in vitro de esferoides de ASCs humanas, abrindo uma nova perspectiva para a medicina regenerativa |
| Abstract: | New bone formation is desirable in a variety of pathological settings, such as osteoporosis. Adipose derived stem/stromal cells (ASCs) are considered a promising cell source for the formation of this tissue in vitro through tissue engineering techniques. A new approach in the field of tissue engineering corresponds to the use of stem-cell spheroids as modular units for fabricate biological tissues in vitro. Thus, the aim of this work was to standardize an osteogenic induction model in vitro from spheroids of human ASCs produced by micromolded nonadhesive hydrogel. ASCs were isolated by mechanical dissociation from human lipoaspirate samples obtained according to the local research ethics committee. Two strategies for osteogenic differentiation induction were evaluated in ASCs spheroids produced by micromolded nonadhesive hydrogel. Spheroids maintained in culture medium without inducing factors were maintained as controls. Measurements of spheroid diameter were performed using phase contrast optical microscopy images. Spheroids induced by hrBMP-7 and by TGF-β3 presented a diameter mean of 370 μm and 450 μm respectively. The hrBMP-7 induced spheroids showed high cell viability (85%), quantified by 7-AAD exclusion detected by flow cytometry. The TGFβ3 induced spheroids also showed high cell viability throughout the weeks of culture, as assessed by commercial fluorescence kit. The TGF-β3-induced spheroids exhibited more calcium deposits than those induced by hrBMP-7, identified by alizarin red staining in histological sections. In both cases, X-ray microanalysis (EDX) showed the presence of calcium only in induced spheroids. The hrBMP-7 induced spheroids showed higher alkaline phosphatase mRNA expression (p = 0.0015) and lower TSP-1 expression (p = 0.00016) when compared to control spheroids. However, there was no difference in RUNX2 and Sox9 expression. The TGF-β3 induced spheroids had a higher composition of typical extracellular matrix components, such as collagen I, osteocalcin, osteopontin, biglycan and tenascin C by immunohistochemistry when compared to those induced by hrBMP-7. In addition, the mechanical resistance to compression of spheroids induced by TGF-β3 was higher when compared to spheroids induced by hrBMP-7 (mean of 360μN and 20μN, respectively). Therefore, it was possible to standardize an in vitro osteogenic induction model of human ASCs spheroids. It was also concluded that induction by TGF-β3 followed by induction with osteogenic medium is able to produce differentiated spheroids with greater efficiency of osteogenic differentiation than spheroids induced by hrBMP-7. In this work, it was possible to standardize a model of in vitro osteogenic induction of human ASCs spheroids, opening a new perspective for regenerative medicine. |
| Palavras-chave: | Ciências Biomédicas Ossos Células-tronco Ossos - Crescimento |
| Área(s) do CNPq: | CIÊNCIAS DA SAÚDE |
| Idioma: | por |
| País: | Brasil |
| Instituição: | Universidade do Grande Rio |
| Sigla da instituição: | UNIGRANRIO |
| Departamento: | Unigranrio::Ensino das Ciências |
| Programa: | Programa de Pós-Graduação em Ensino das Ciências |
| Citação: | KRONEMBERGER, Gabriela Soares. Produção de esferoides a partir de células-tronco/estromais de tecido adiposo humano para fabricação de tecido ósseo in vitro. 2018. 128 f. Dissertação (Programa de Pós-Graduação em Biomedicina Translacional) - Universidade do Grande Rio, Duque de Caxias, 2018. |
| Tipo de acesso: | Acesso Aberto |
| Endereço da licença: | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ |
| URI: | http://localhost:8080/tede/handle/tede/354 |
| Data de defesa: | 31-Out-2018 |
| Aparece nas coleções: | Coleção de Pós-Graduação em Biomedicina Translacional |
Arquivos associados a este item:
| Arquivo | Descrição | Tamanho | Formato | |
|---|---|---|---|---|
| Gabriela Soares Kronemberger.pdf | Completo | 4,16 MB | Adobe PDF | Baixar/Abrir Pré-Visualizar |
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